大家好，今天给各位分享免疫荧光一抗孵育时间的一些知识，其中也会对免疫荧光4度过夜几小时进行解释，文章篇幅可能偏长，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在就马上开始吧！
本文目录
一、免疫荧光的 *** 有什么注意环节
1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构 *** ，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰 *** 等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。
3、血清封闭：为防止内源 *** 非特异 *** 蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。
4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果更佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过宿和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。
5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37℃立即观察，若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行 *** 。一般常用DAPI复染。
7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲 *** 等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡， *** 是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异 *** 染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。PBS的pH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异 *** 染色），建议pH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中 *** 及弱碱 *** 条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸 *** 条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）
9、拍照：有条件的话更好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行 *** 作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护 *** ；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分 *** 后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源更好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
二、免疫组化注意事项
1、抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重，此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。
2、石蜡切片在 *** 过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳 *** 率，一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。
3、注意检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。
4、抗选择单 *** 抗体易出现阴 *** 结果，因为灵敏度低但特异 *** 好；一抗的speciesreactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴 *** 结果。
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5、抗体孵育时间过短，容易导致阴 *** 结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min；二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。
6、抗体浓度过低。这是阴 *** 结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度 *** ，然后决定是向高还是低方向摸索。
一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳 *** 率就越高，反之亦然。
7、血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。
8、细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞 *** 白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。
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1、免疫荧光细胞化学技术：将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光，从而可以确定组织中的抗原 *** 或定量。
2、免疫酶细胞化学技术：是目前免疫组织化学研究中最常用的技术，基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶 *** 产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行 *** 或定 *** 研究。
3、免疫胶体金技术：就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异 *** 的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定 *** ， *** 或定量研究。由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的 *** 研究。
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异 *** ，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异 *** 的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。
由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的 *** 将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定 *** ， *** 或定量的研究。
参考资料来源：/baike.baidu *** / *** /免疫组化/10004329?fr=aladdin"target="_blank">百度百科-免疫组化
三、免疫荧光一抗孵育2天可以吗
1、一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37°C的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4°C的条件下，孵育18-24小时左右。
2、如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异 *** 吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特 *** 显色。
免疫荧光一抗孵育时间和免疫荧光4度过夜几小时的问题分享结束啦，以上的文章解决了您的问题吗？欢迎您下次再来哦！
