大家好，感谢邀请，今天来为大家分享一下wb转膜时间的问题，以及和wb转膜要多久的一些困惑，大家要是还不太明白的话，也没有关系，因为接下来将为大家分享，希望可以帮助到大家，解决大家的问题，下面就开始吧！
本文目录
一、wb转膜条件公式
1、wb转膜条件公式：10% SDS溶液(m/v)。
2、将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种 *** ：毛细管印迹法和电泳印迹法。
3、常用的电泳转移 *** 有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者 *** 作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
4、在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为常数，是该带电粒子的物化特征 *** 常数。不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。
二、wb转膜时间设置到点自动停掉吗
1、当然可以停止，目前做蛋白量变化分析往往需要β-actin作为内参。
2、比如你的目的蛋白是20，那β-actin是40多。这时候转膜时间是不一样的。
3、做实验最重要的是消除无关变量，如果用两个槽转膜，那这两个转印槽多少会有不同。所以更好用同一个转印槽，两个三明治夹子转印。一个夹子转目的蛋白，一个夹子转β-actin。目的蛋白转印1小时后把夹子取出，然后继续转印β-actin。这个没有任何问题，我们一直都是这么做的。当然停止电源取出目的蛋白夹子速度要快，不要动β-actin的那个夹子。
三、wb实验的原理和步骤
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。
与相对应的之一抗体特异 *** 结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异 *** 目的基因表达的蛋白成分。
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定 *** 检测目的蛋白时细胞样品的处理 *** ，其余的样品制备 *** 参阅相关文献。
2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3.加入1X SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上 *** 作。
4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘 *** 。
1.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2.配 10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
3.当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4.配 4％的浓缩胶,加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子 *** 浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5.用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6.在电泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。
7.连接电泳槽到电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压70～ 80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。
1.将胶浸于转移缓冲液中平衡 10min。注意：若检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5秒钟。
3.装配转移三明治:海绵3层滤纸胶膜，3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面(黑色面)。
4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液， *** 上电极，100V，1h(电流约为 0.3A)。
5.转膜结束后，切 *** 源，取出杂交膜。
1.用25ml TBS洗膜5min，室温，摇动。
2.置膜于25ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动。
4.加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
6.加入合适稀释度的碱 *** 磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
将 A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、 *** 作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：
①样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳 *** 对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；
②蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；
③蛋白的转膜。运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间。
④抗体的运用。抗体的反响种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；
⑤蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl浓度等；
⑥抗原被 *** 液遮盖。换用不同的 *** 液，优化 *** 液中蛋白质浓度并缩短 *** 时间；
⑦甲醇浓渡过高。会招致蛋白质与 SDS别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。
二、非特异 *** 条带或条带位置不对
WB结果中目的条带之外的条带被称为非特异 *** 条带，有时非特异 *** 条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。普通来说惹起这类问题的主要要素有：
①抗体的非特异 *** 分离。通常以为，多抗的特异 *** 不如单抗，更容易产生非特异 *** 条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异 *** 分离的可能，倡议设二抗阴 *** 对照；
②样品蛋白量过高。恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与 *** 时间可防止蛋白量过高对实验结果的 *** 影响；
③蛋白质降解。会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品；
④细胞传代次数过多。会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株；
⑤蛋白存在复合物。有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物；
⑥蛋白存在剪接体或多种修饰方式。局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活 *** ，在 WB中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。
在局部 WB结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观，难以用于文章发表。这种问题的可能缘由有以下几点：
① *** 不充沛。背景过高的主要缘由之一是 *** 有问题，倡议运用适宜的 *** 剂（脱脂奶粉、BSA等），优化反响浓度与 *** 时间，同时留意防止呈现抗体与 *** 剂的穿 *** 反响，以及 *** 剂与含有目的抗原，内源 *** 生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题；
②洗膜不充沛。恰当增加洗膜次数弛缓冲液体积，进步吐温20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的问题；
③抗体的运用。一抗浓渡过高是高背景的缘由之一，且二抗也存在与 *** 剂非特异 *** 分离的可能，因而倡议恰当优化一抗浓度，并设二抗阴 *** 对照；
④曝光时间长。倡议在实验中采用适宜的曝光时间。
有时 WB结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下：
①电泳时电压、电流过高。会招致条带迁移速率过快以及 SDS-PAGE温度升高，并可能使得条带弥散、外形变形。倡议运用适宜的电泳条件并坚持低温；
②电极不均衡。会招致条带偏斜，上样时在无样品的胶孔中参加等量样品缓冲液可防止这种状况；
③上样量过高，样品中盐离子浓度较大。上样量过高可能会招致条带弥散，样品中的盐离子浓度不分歧则会招致条带不齐等问题。因而在上样时需保证样品量分歧且恰当，并坚持相同的、较低的盐离子浓度。
④制胶问题。在配胶时一定要保证充沛混匀，平均凝胶，上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡。
⑤电泳缓冲液寄存过久。电泳实验中的缓冲液假如放置过久也会对结果有 *** 影响，因而倡议及时改换新的缓冲液。
有时在 WB做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点：
①试剂、仪器等污染。倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂；
②转膜时有气泡。确保在转膜过程中将气泡扫除洁净；
③抗体孵育时与膜接触不充沛。确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；
④曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；
⑤膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。
四、wb电转要多久
1、wb电转的时间是由电转方式以及蛋白分子量决定时间长久。
2、如果是湿转的话，60KDa的蛋白转膜60分钟~90分钟一般就足够了。转膜完成后可以将SDS-PAGE胶片去做一下考染，看看是否有未完全转膜的条带。如果有的话，可以下次适当延长专膜时间。
3、电转选择恒流的话，每个转印槽150 mA，10KD以下转印40min，10-30KD转印50min，30-100KD转印70min，100kd以上转印80min，转印完毕可用丽春红S染膜检测转印是否成功，转印结束后去除NC膜置于丽春红S溶液中，室温5-10min即可看见红色条带，用TBS洗数次即可洗掉红色条带进行后续实验。
五、wb电转时间过久有影响吗
wb电转时间过久有影响，会时间过久会导致小分子蛋白很容易转过头，不在膜上，而转到滤纸上了。
电转印膜的选择：有 NC膜、重氮化膜和阳离子尼龙膜， PVDF膜。其中 NC膜使用的最为普遍，它的蛋白质容量大，可用各种染色 *** 进行检测，但是它与蛋白质的结合是非价 *** 的，膜干燥后很脆。
外膜的孔径大小也是考虑的重要因素，目的蛋白30KD以下用0.22 um孔径的 NC膜，30KD以上用0.45 um孔径的 NC膜。
六、转膜时间怎么算
1、根据中国生物信息网资料显示转膜电流大小一般分子量大于100kda可用200 *** 恒流转膜100min按一个转膜槽计算，分子量小于100kda宜减小电流，可用160-180 *** 转膜90min分离的蛋白分子量小于100kda的选择转膜时间为120min分子量大于100kda的选择转膜时间为150min。
2、转膜，是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上，同时维持其相对位置和分辨率的过程。
OK，关于wb转膜时间和wb转膜要多久的内容到此结束了，希望对大家有所帮助。
